技术领域
本发明涉及微流控与生物医学工程技术领域，具体涉及一种声光耦合微流控分选与检测系统及其方法，应用于生物医学检测与单细胞分析，利用驻波声场实现非接触式力学分选，并通过光学散射与荧光实时检测判别目标细胞，结合在线校准与反馈控制以提升分选选择性与细胞活性。
背景技术
现有单细胞分选技术主要包括流式荧光分选（FACS）、磁性分选（MACS）、惯性微流控分选、介电泳分选以及声学分选等。FACS具备较高分辨率与复杂多参数判读能力，但系统复杂、剪切应力与喷滴冲击较高，可能对敏感细胞造成损伤，并且存在气溶胶生物安全风险；MACS依赖标记，选择性受限于抗体与磁珠的结合特性，难以实现精细的多参数阈值判定；惯性微流控分选通量较高，但流体剪切和惯性作用强，易影响细胞活性且对颗粒尺寸敏感；介电泳对介电特性敏感，但对介质导电率与温升较敏感；传统声学分选利用驻波产生的体相声辐射力进行非接触操控，具备温和、对活性友好等优势，但在以下方面仍存在不足：
- 检测—执行的联动较弱，缺乏与光学检测的高时效耦合，难以在高速流下实现准确、实时的单体导向分流；
- 系统对环境漂移（温度、耦合状态、介质属性）不敏感的假设导致长期运行中频偏与驻波节点漂移，降低稳定性与选择性；
- 流体管理不完善，局部高剪切、脉动流与气泡干扰影响分选精度与细胞活性；
- 芯片多为一次性与实验室定制，接口非标准化，不利于仪器化与转化应用。
因此，亟需一种将声学分选与光学检测深度耦合、具备在线标定与反馈控制能力、在低应力流体环境下稳定运行且接口标准化、便于复用的微流控系统。
发明内容
要解决的技术问题
本发明旨在解决以下技术问题：
- 实现在连续流条件下，基于实时光学散射/荧光检测的目标细胞快速判别与声学相位动态调节，实现非接触、选择性高的单体导向分流。
- 通过在线校准与闭环反馈控制，抑制频率漂移、声学耦合变化与流体条件波动对分选精度的影响，提升系统鲁棒性与长期稳定性。
- 构建低剪切、低脉动的流体输运环境，降低对细胞的机械应力与温升，保持高活性与高存活率。
- 采用可复用芯片与标准化流体/电学/光学接口，便于系统集成、维护与临床/产业转化。
技术方案
为实现上述目的，本发明提供一种声光耦合微流控分选与检测系统，其包括芯片本体、声学致动模块、光学检测模块、流体管理模块、控制与算法模块、在线标定模块及标准化接口组件；并提供相应的分选方法与在线校准方法。系统关键结构与功能如下：
- 芯片本体
- 基底材料：优选玻璃-硅-玻璃键合或玻璃/石英-聚合物复合结构，具备良好的声学传输与化学稳定性；通道内表面可进行抗吸附涂层处理（如聚乙二醇化或亲水防污涂层），以减少细胞黏附与生物污染，支持清洗复用。
- 微通道结构：包括进样通道、鞘流通道、主通道、检测区、声学致动区与分流结点，以及至少两个支路（目标支路与非目标支路）。主通道宽度优选80–150 μm，高度30–80 μm，检测区长度1–3 mm，致动区长度2–8 mm。
- 分流结点：Y形或T形结构，结点至两支路在平面内等阻设计，支路宽度按体积分配需求可为主通道的0.6–1.2倍，便于通过声场将目标推移至目标支路侧。
- 热管理：芯片背面可设置散热片或导热底板，控制工作温升小于5 ℃。
- 声学致动模块
- 致动器：包括至少一对布置在主通道两侧的压电换能器（PZT片）或表面声波换能器（IDT）。优选采用对置PZT形成横向一阶驻波，工作频率0.5–10 MHz（优选1–5 MHz），以获得跨通道半波长的稳定驻波节点。
- 相位控制：两致动器分别由独立射频驱动通道供能，具备0–360°连续可调相位与幅度控制，响应时间小于100 μs。通过改变相位差，在通道横向实现节点位置的快速平移，从而将目标粒子导向预定支路。
- 耦合层与声学匹配：在PZT与芯片之间设置声耦合介质与匹配层，减少反射与能量损失，并通过温度与阻抗监测实现工况监控。
- 光学检测模块
- 检测方式：在检测区布置光学检测窗口，采用激光激发与多通道检测，实现前向/侧向散射与一至多通道荧光信号的同步采集。光路可采用光纤耦合形式，激发波长范围405–640 nm，检测带宽匹配常用荧光团。
- 光学采集器件：前向散射使用光电二极管，荧光信号使用光电倍增管或雪崩光电二极管；可选高速相机用于节点可视化与校准。
- 时序与定位：检测区与致动区间距按流速与控制延时设计，使粒子从检测到进入致动区的飞行时间与控制响应匹配（例如0.5–5 ms），保证单体触发与相位切换精准对齐。
- 流体管理模块
- 低剪切泵：采用经阻尼的注射泵或隔膜泵，配合脉动抑制器与阻抗匹配缓冲腔，使主通道剪切应力典型值小于20 dyn/cm²；流量范围1–200 μL/min，雷诺数<100，保持层流。
- 鞘流与稳流：设置双侧或多路鞘流以实现粒子单列化，入口设微型滤网与气泡捕集器，减少堵塞与声学散射异常。
- 阀与切换：设置微型电磁阀实现标定/清洗/样本切换，出液端配压力释放与废液安全收集。
- 控制与算法模块
- 硬件：以FPGA/高速微控制器为核心，集成多通道模数转换器、相位/幅度可调的射频驱动器、温度与阻抗测量模块。
- 信号处理：对散射与荧光信号进行基线校正、脉冲峰值/面积提取、时间戳记录与多阈值判别；可实现多参数逻辑门（如AND/OR/比值门）。
- 触发与相位控制：根据粒子在检测区的判别结果与速度估计，生成同步触发，动态调整致动器相位差与幅度，实现单体导向到目标支路；提供防碰撞队列管理，避免相邻事件干扰。
- 反馈控制：闭环调整工作频率、幅度与相位偏置，以最大化节点稳定性与分选准确率；监测温度、流量、信号强度用于自适应补偿。
- 在线标定模块
- 标定样品：使用已知粒径与荧光强度的标准微球及具有已知声学对比因子的参考颗粒。
- 标定流程：自动注入标定样品，扫描频率与相位，测定节点位置与光学响应；拟合通道声学传输函数，锁定最佳工作点；周期性插入少量标定颗粒进行漂移监测与参数微调。
- 自检：对光路强度、背景噪声、温度与换能器阻抗进行自检，生成健康状态评分。
- 标准化接口与可复用设计
- 流体接口：Luer或M6标准接头，支持快换；电学接口：SMA或MCX；光学接口：FC/PC或SMA光纤接口；机械接口：定位销与燕尾槽基座用于快速对准。
- 复用与清洗：芯片可承受常规去污流程（如表面活性剂冲洗、去离子水/缓冲液循环与温和消毒），并具备更换式O形圈密封，循环使用次数≥20次（视材料与清洗流程而定）。
- 分选方法
- 步骤：样本与鞘流加载—在线自检与标定—进入检测区完成散射/荧光判别—依据判别结果与飞行时间触发相位切换—粒子在致动区受声辐射力偏转—于分流结点进入目标/非目标支路—周期性微标定与参数修正—收集与数据记录。
- 关键控制：保证事件间最小时间间隔大于系统总响应时间；对高密度事件实施抑制策略或优先级调度，避免误分。
上述技术特征可相互任意组合，除非相互矛盾或在技术上不可行。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
- 双场耦合分选：将光学散射/荧光多参数判别与声学驻波非接触操控耦合，实现选择性高与细胞活性兼顾；在不产生气溶胶的前提下实现单体导向分流。
- 在线校准与反馈控制：通过频率、相位与幅度闭环调节，补偿温漂与耦合变化，长期运行下分选准确性与稳定性提升。
- 低应力流体环境：稳流与脉动抑制设计显著降低剪切与震荡，减少细胞损伤，适用于脆弱细胞类型。
- 标准化与可复用：流体、电学与光学接口标准化，便于仪器化集成；芯片耐受清洗并可重复使用，降低成本。
- 可扩展性：检测通道可扩展至多荧光、多参数门控；致动阵列可扩展至多路并行分选，提高通量。
附图说明
- 图1 系统总体结构示意图（包含流体、声学、光学与控制模块的连接关系）
- 图2 微流控芯片平面结构及分流结点示意图
- 图3 声学致动与驻波节点位置调制原理图
- 图4 光学检测区布局与光路示意图（散射与荧光）
- 图5 控制与算法时序示意图（检测—判别—触发—相位切换—分流）
- 图6 在线标定流程与频率/相位扫描结果示意图
- 图7 流体稳流与气泡捕集结构示意图
- 图8 接口标准化与安装夹具示意图
- 图9 温度与阻抗监测的闭环控制框图
- 图10 分选效果示意（事件轨迹与支路统计）
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于此。
一、芯片结构与材料
- 结构：玻璃-硅-玻璃三层键合；中间硅片刻蚀形成主通道与分流结构，通道高50 μm、主通道宽100 μm；分流结点为对称Y形，两支路宽各100 μm。
- 表面处理：通道内壁以等离子活化后进行亲水抗污涂层处理，接触角40–60°；以减少细胞黏附。
- 光学窗口：上玻璃层在检测区抛光并减反，保证信噪比；光学窗口长度约1.5 mm。
- 安装：芯片装入铝合金夹具，夹具背面设散热片；两侧留出PZT贴装位与SMA连接口。
二、声学致动配置
- 换能器：两片10×5×1 mm PZT对置安装于主通道两侧，通过薄层耦合胶粘接；各自连接至独立RF通道。
- 工作参数：频率2.1–2.4 MHz（根据实际通道与材料声速确定），幅度5–20 Vpp可调；相位差0–180°连续可调以在横向移动驻波节点位置约0–50 μm。
- 监测：集成热敏电阻监测局部温度；驱动端测量换能器阻抗用于耦合评估。
三、光学检测配置
- 激发：488 nm与561 nm两路激光经光纤耦合入射至检测区；功率典型2–10 mW，脉宽连续。
- 检测：前向散射采用硅光电二极管，荧光以带通滤光片分光至两个APD通道；采样频率≥2 MHz。
- 信号处理：实时峰值/面积/宽度提取并计算荧光比值，实现尺寸与标记双参数门控。
四、流体管理与稳流
- 泵与阻尼：注射泵输出经柔性阻尼管与稳压缓冲腔进入芯片入口；总流量20–100 μL/min，鞘流：样本=3:1。
- 气泡管理：入口设亲水微孔气泡捕集器，出液端设置背压调节阀维持稳定压力（例如5–15 kPa）。
- 剪切估算：在100 μm方形截面、50 μL/min条件下，平均剪切应力约在10–20 dyn/cm²范围内。
五、控制与算法
- 硬件：FPGA实现多通道ADC采集（≥12 bit, ≥5 MS/s），与双路相位可编程RF合成器；MCU负责上位机通信与策略管理。
- 事件时序：基于散射信号到达时间估计粒子速度；按检测区至致动区中心距离（例如1.2 mm）计算飞行时间；触发窗口开放时间与相位切换沿提前量根据速度自适应调整。
- 门控策略：设定荧光强度阈值与散射范围，实现目标/非目标判别；对密集事件采用最小间隔限制（如≥300 μs）与冲突回退策略避免误触发。
- 反馈控制：周期性插入标定珠，监测分流统计与节点位置偏差；由PID对频率/相位偏置/幅度进行微调，维持分选准确率。
六、在线标定流程
- 初始扫描：在无流或低流条件下，以标定珠进行频率扫（步进1–5 kHz）与相位扫（步进5–10°），寻找节点稳定且偏转效率最大的设定点。
- 光学校准：校正PMT/APD增益、背景与串扰；记录标准荧光珠的峰值分布，自动设定阈值。
- 运行标定：每隔n分钟或m个事件自动注入少量标定珠，评估分支统计偏差，若超阈值则重新微调参数。
- 自检与安全：温度超限或阻抗异常触发功率限制与停机保护。
七、可复用与清洗
- 清洗流程：使用PBS含0.05%非离子表面活性剂以2–5倍工作流量冲洗5–10 min，再以去离子水与70%乙醇依次冲洗，干燥后低温保存。
- 更换件：O形圈定期更换；光学窗口在无尘环境擦拭；耦合层按需补涂。
实施例
实施例1：荧光微球分选验证
- 材料与条件：5 μm绿色荧光微球与非荧光微球1:9混合，样本浓度2×10⁶/mL；总流量40 μL/min，鞘流：样本=3:1；工作频率2.25 MHz，相位偏置初始90°。
- 过程：完成在线频率与相位扫描后，以荧光阈值门控判别，事件平均间隔约400 μs；触发窗口150 μs，相位切换提前量依据速度实测设定为40 μs。
- 结果：在连续运行60 min条件下，目标支路荧光纯度≥98%，回收率约95%；误分率稳定<2%；温升<3 ℃；系统自动进行了每10 min一次的微标定，无需人工干预。
实施例2：外周血单个核细胞（PBMC）中稀有标记细胞分选
- 样本：经红细胞裂解后的PBMC，使用低毒荧光抗体标记目标亚群，细胞浓度5×10⁵/mL。
- 参数：总流量50 μL/min；工作频率2.18 MHz；节点偏置随时间闭环调整；门控采用荧光强度与散射联合判别，采用密集事件抑制以确保单体触发。
- 评估：分选后使用活死染色检测细胞活性；统计回收率与纯度。
- 结果：目标细胞回收率约90–94%，纯度≥95%；活性维持>95%；与无分选对照相比，细胞增殖能力未见显著差异（48 h培养评估）。
实施例3：无标记散射门控与标签辅助混合策略
- 样本：未标记PBMC与少量荧光标准珠混合，用于在线漂移监测。
- 策略：以前向散射区分尺寸区间，以弱荧光标准珠实时监控光路与声学漂移；当检测到散射分布中心偏移>10%或标准珠分流偏差>5%时，系统自动重标定。
- 结果：无标记分选的尺寸选择性保持稳定；长时间运行（4 h）中分选准确率维持在初始值±3%范围内。
可选改型与扩展
- 可采用表面声波IDT在锂铌酸盐基底上形成驻波，实现更高频率与更精细控制；亦可使用多对换能器形成二维声场，实现二维聚焦与多支路分选。
- 光学检测可扩展为三至四通道荧光，并加入时间延迟积分以提升弱信号检测灵敏度。
- 在分流端增加二级致动区，实现级联分选以提高纯度或实现多亚群分离。
- 增设微型温度控制模块（如薄膜加热与热电制冷），在低室温环境保证生理温度操作。
上述实施例用于说明本发明的技术方案与效果，相关参数可根据具体样本类型、芯片尺寸与目标通量进行调整。在不背离本发明精神的前提下所作的等同替换与变形，均应落入本发明的保护范围内。
